L’HPTLC (High-Performance Thin-Layer Chromatography) est une technique analytique de chromatographie liquide polyvalente. Elle est couramment utilisée aussi bien en contrôle qualité qu’en recherche. Mais comment se déroule une analyse HPTLC ? Voici les étapes détaillées, du dépôt de l’échantillon à l’interprétation des résultats.
💊 Ph. Eur. : Vous pouvez retrouver le chapitre dédié à cette technique analytique dans les prescriptions générales de la Pharmacopée Européenne : 2.2.27 Chromatographie sur Couche Mince
0️⃣ La plaque HPTLC : pré-traitements possibles et utiles dans certains cas
Tout commence par une plaque de silice haute performance.
🧐 Comparées aux CCM classiques, les plaques HPTLC offrent une meilleure résolution, une séparation plus fine et une reproductibilité accrue. Leurs particules absorbantes possèdent une granulométrie et une épaisseur de couche plus fines.
D’une hauteur de 10 cm, et grâce à ses propriétés de phase, les plaques HPTLC permettent d’avoir une migration plus rapide, en consommant moins de solvants.
On peut faire subir à la plaque des traitements facultatifs avant l’application:
- Lavage : Dans un solvant polaire ou organique, par exemple de l’isopropanol, la plaque est développée puis séchée. Cette étape permet de s’affranchir des éventuelles impuretés.
- Activation : La plaque peut être chauffée à l’étuve à 120°C pendant 20 min. Cela permet d’éliminer l’eau résiduelle présente.
- Prétraitement chimique : des révélateurs chimiques peuvent être déposés sur la plaque avant migration. On parle alors de pré-dérivatisation.
1️⃣ Application de l’échantillon : un dépôt précis et reproductible
L’application de l’échantillon sur la plaque HPTLC est effectuée grâce à un système par pulvérisation garantissant une répartition homogène et reproductible.
🧐 Pourquoi l’automatisation est importante ?
✔ Permet une séparation optimale des analytes.
✔ Réduit les erreurs liées à une application irrégulière.
✔ Assure une meilleure sensibilité
✔ Permet une comparaison fiable entre les échantillons.
2️⃣ Développement chromatographique : la séparation des composés
Après l’application, la plaque est placée dans une cuve de développement saturée en phase mobile. La migration du solvant par capillarité entraîne la séparation des composés selon leur affinité avec la phase stationnaire et la phase mobile.
🧐 Facteurs influençant la séparation :
✔ Composition de la phase mobile : solvants adaptés aux analytes.
✔ Saturation de la cuve pour une migration homogène.
✔ Température et humidité du laboratoire.
🔍 L’optimisation du système chromatographique est essentielle pour une séparation efficace et reproductible.
3️⃣ Séchage et révélation : rendre les composés visibles
Après migration, les composés doivent parfois être révélés pour être détectés. C’est le cas de ceux qui n’ont pas de chromophores. On peut aussi dérivatiser pour avoir une analyse plus spécifique selon les classes de composés ciblées. Plusieurs modes de détection sont possibles :
✔ Observation en UV (254 nm ou 366 nm) pour les composés qui absorbent et/ou fluorescent.
✔ Révélation chimique spécifiques aux classes de composés d’intérêt.
✔ Révélation biologique pour étudier rapidement les activités biologiques des échantillons.
🧐 L’avantage de l’HPTLC ?
La possibilité de tester plusieurs modes de détection sur une même plaque donc sur plusieurs témoins et échantillons en même temps. Impossible en HPLC.
4️⃣ Densitométrie et quantification : mesurer avec précision
La densitométrie optique permet de quantifier les analytes directement sur la plaque. Un scanner HPTLC analyse la densité des taches chromatographiques et fournit des résultats précis, comparables à ceux de l’HPLC.
🧐 Avantages de la quantification HPTLC :
✔ Analyse non destructive, possibilité de réutiliser la plaque.
✔ Plusieurs longueurs d’onde disponibles pour une détection optimale.
✔ Courbes de calibration fiables et reproductibles.
Grâce aux systèmes d’imagerie et de documentation, les pistes d’échantillons peuvent être extraites et exportées pour une comparaison visuelle immédiate de plusieurs séries d’analyses.
🔬 Pour une identification plus poussée, l’HPTLC peut être couplée à la spectrométrie de masse (HPTLC-MS), permettant l’analyse structurelle des composés séparés.
5️⃣ Interprétation et validation des résultats
Une fois la quantification réalisée, l’interprétation des résultats repose sur plusieurs critères analytiques :
📌 Comparaison avec des standards de référence pour confirmer l’identification.
📌 Calcul des Rf (rapport frontal) pour évaluer la reproductibilité de la séparation.
📌 Vérification de la courbe de calibration, de la précision et des limites de détection/quantification (LOD/LOQ) pour garantir la fiabilité des résultats.
🧐 Une analyse HPTLC bien menée offre une quantification robuste, une visualisation immédiate et une flexibilité analytique unique.
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Conclusion : une technique puissante et flexible
L’HPTLC suit un processus rigoureux et automatisé, garantissant des analyses fiables, rapides et reproductibles. Elle est idéale pour le screening, la comparaison de lots et le contrôle qualité, tout en offrant un impact environnemental réduit grâce à une consommation limitée de solvants.
Loin d’être une simple alternative, l’HPTLC est une méthode performante, complémentaire aux autres techniques chromatographiques, et en constante évolution grâce aux nouvelles technologies analytiques.
💬 Et vous, utilisez-vous l’HPTLC dans vos analyses ?
